La cloroquina 98

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Afiliación: Departamento de Oncología Radioterápica, Hospital Universitario de Friburgo, Friburgo, Alemania Resumen Se preguntó si los inhibidores de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) / Akt, que es muy activo en las células madre del cáncer (CSC) y regulados por incremento en la respuesta a los tratamientos genotóxicos , promover - irradiationIR) la muerte celular inducida en las células, altamente radioresistant los pacientes derivados de madre-como glioma (SLGCs). Sorprendentemente, en la mayoría de los casos, los inhibidores no promueven la muerte celular inducida por IR. Por el contrario, la fuerza citostático Ly294002 y PI-103 incluso tendían a reducirlo. Dado que se indujo la autofagia se examinó si la adición del inhibidor de la autofagia cloroquina clínicamente aplicables (CQ) daría lugar a la muerte celular en SLGCs. La triple terapia con CQ a dosis tan bajas como de 5 a 10 M de hecho causó una fuerte apoptosis. A dosis ligeramente superiores, CQ promovida por sí sola fuertemente la apoptosis inducida por IR en todas las líneas SLGC examinados. La fuerte apoptosis en combinaciones con CQ se asocia invariablemente con una fuerte acumulación del marcador autophagosomal LC3-II, lo que indica la inhibición de la autofagia tarde. Por lo tanto, los efectos de la autofagia promotoras de PI3K / Akt inhibidores de la vía aparentemente obstaculizan la inducción de muerte celular en SLGCs - irradiated. Sin embargo, como se muestra aquí por primera vez, a finales del inhibidor de la autofagia CQ promueve fuertemente la muerte IR inducida de células en células madre cancerosas altamente radioresistant, y combinaciones triples de CQ, IR y un Akt reducción permiso de PI3K / inhibidor de la vía de la dosis CQ requerida para desencadenar la muerte celular. Cita: Firat E, Weyerbrock A, S Gaedicke, Grosu A-L, Niedermann G (2012) cloroquina o cloroquina-PI3K / Akt inhibidor de la ruta Combinaciones promover decididamente la muerte celular inducida por - Irradiación en células primarias Stem-Como glioma. PLoS ONE 7 (10): e47357. doi: 10.1371 / journal. pone.0047357 Editor: Jeffrey K. Harrison, Universidad de Florida, Estados Unidos de América Recibido: 12 Junio ​​2012 ha aceptado: September 11, 2012 Publicado: 16 Octubre, 2012 Copyright: Firat et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan. Financiación: Esta investigación fue apoyada por una beca de la Fundación Clotten a GN. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. Introducción El glioblastoma multiforme (GBM) OMS grado IV es el más común y el tumor cerebral más agresivo. Es siempre mortal, y el tratamiento estándar con resección quirúrgica más radioquimioterapia basada en la temozolomida da una supervivencia media de 14,6 meses sólo 1. Las células madre tumorales altamente resistentes a la terapia parecen ser al menos parcialmente responsable de la limitada eficacia de las terapias actuales 2. 3 . fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) / Akt (proteína quinasa B) de señalización se activa de forma aberrante en glioblastomas y otros tumores, a menudo debido a la mutación o pérdida del homólogo de fosfatasa y Tensin (PTEN) antagonizar clase I PI3K de señalización, o para la amplificación o sobreexpresión de receptores de factores de crecimiento que actúan aguas arriba de la clase I PI3K 4. 5. la activación constitutiva de la señalización de PI3K / Akt se asocia no sólo con el crecimiento agresivo del tumor, sino también con la resistencia a la radio y quimioterapia. La regulación positiva de la vía PI3K / Akt en respuesta a los tratamientos genotóxicos contribuye a esta resistencia 6. PI3K señalización / Akt estimula una gran variedad de moléculas de aguas abajo, algunos a través de la diana mamífera de rapamicina (mTOR). Tanto la autofagia, una vía de degradación y reciclaje lisosoma dependiente desencadena principalmente como una respuesta de supervivencia a diversas tensiones subletales, y la apoptosis, la forma más común de muerte celular programada, están regulados por PI3K / Akt / señalización 7 9. La PI3K / Akt mTOR vía también es considerada como una vía stemness importante para la supervivencia de las células madre del cáncer (CSC) 10. GBM aparentemente conforme al modelo CSC, siendo uno de los tumores sólidos mejor caracterizados estudiados bajo este aspecto 2. 3. De acuerdo con el modelo de CSC, muchos tumores pueden ser impulsados ​​por una subpoblación de células madre similares a células madre cancerosas, a menudo se denomina. CSC en células de glioma generales y de tallo como (SLGCs) en particular, han demostrado ser extraordinariamente resistente a-irradiación (IR) y quimioterápicos. apoptosis Bloqueado y la inducción de la autofagia aparecen crucial para esta resistencia que contribuye a la supervivencia de SLGCs tratados genotoxically 3. 11. Los resultados contradictorios sobre los efectos de las combinaciones de IR con inhibidores de la vía PI3K / Akt se han obtenido para las líneas celulares de glioma convencionales. Tanto la falta de sensibilización y fuerte de sensibilización a la muerte celular inducida por la IR se han notificado 12 17. Dos estudios han descrito la sensibilización de las células tumorales madre-como a IR por el perifosine inhibidor de Akt en un mamaria transgénicos y en un modelo de tumor de meduloblastoma de ratón 18. 19. Sin embargo, casi nada se sabe acerca de los efectos de los inhibidores de la vía PI3K / Akt en la radiosensibilidad de células madre cancerosas humanas derivadas del paciente. Sólo un estudio informó mejorado la actividad de caspasa en una línea SLGC - irradiated tratado previamente con el inhibidor de PI3K LY294002 o una dosis citotóxica del inhibidor de Akt III (SH6) 20. El objetivo inicial de este estudio fue examinar si los diversos tipos de PI3K farmacológica / inhibidores de la vía Akt promueven la muerte celular inducida por IR cuando se administra a un panel de líneas primarias SLGC altamente radioresistant. Como los inhibidores no mejoran generalmente la muerte celular, pero se observó la autofagia, que también examinó combinaciones triples con cloroquina (CQ), un inhibidor de la autofagia aplicable clínicamente conocido para activar la apoptosis en las células tumorales autofágicas convencionales. Mostramos aquí por primera vez que las combinaciones triples de IR con CQ y inhibidores de la vía seleccionados PI3K / Akt son citotóxicos fuerte para los CAC altamente radioresistant a dosis bajas de CQ y que CQ, ligeramente dosis más altas, promueve fuertemente la muerte celular inducida por IR en células madre cancerosas altamente radioresistant. la muerte celular fuerte observada en combinaciones dobles y triples con CQ produjo a través de la apoptosis provocada por la inhibición de la autofagia tarde. Resultados Estado Akt y de inhibición de Akt por inhibidores de la vía PI3K Akt / Se examinaron las líneas SLGC a corto plazo a partir de cuatro diferentes (GBM GBM4, 8, 22 y G166). Las líneas expresan marcadores stem - y progenitoras neurales, diferenciar tras la exposición a FBS o ácido retinoico, son tumorigénicos sobre xenotrasplantes de serie y son altamente resistentes a IR 21. 22. Las cuatro líneas de expresión de Akt activado (pAkt) mostró fosforilado en la serina 473 . Dos de las tres líneas con altos niveles de pAkt no expresó PTEN, que regula negativamente la actividad de Akt (Fig. 1A). Expandir la figura 1. PI3K estado de activación / Akt y la inhibición de la fosforilación de Akt por los inhibidores de PI3K / Akt en SLGCs primarias. (A) análisis de transferencia de Western de Akt basal, p-Akt, y los niveles de expresión de PTEN. Sox2 se muestra como un marcador stemness y-actina como control de carga. (B) Inhibición de la fosforilación de Akt (serina 473) y de la proteína ribosomal S6 por el inhibidor de Akt III (Akti), LY294002 y PI-103. Se trataron las células con los inhibidores durante 2 h antes de recoger las muestras para el análisis. A continuación se determinó para estas líneas la capacidad inhibidora de tres inhibidores diferentes PI3K / Akt: el inhibidor de amplio espectro PI3K LY294002, el inhibidor de éter fosfatidilinositol analógica lípidos Akt III (SH-6), y PI-103, un compuesto pyridinylfuranopyrimidine, siendo un inhibidor dual de la clase I PI3K y mTOR 23 (fig. 1B). submicromolares dosis de PI-103 fosforilación de Akt inhibe por completo (en la serina 473) y de la proteína ribosomal S6, un objetivo importante aguas abajo de la vía PI3K / Akt / mTOR, que regula la síntesis de proteínas y la proliferación celular. LY294002 también inhibió la fosforilación de estas dos proteínas de manera eficiente. La inhibición por Akt inhibidor III fue más débil, en particular en las líneas con elevada expresión de pAkt (Fig. 1B). PI3K / Akt inhibidores de la vía no promueven generalmente IR inducida por la muerte SLGC A pesar de que sólo se inhibió parcialmente la fosforilación de Akt, Akt inhibidor III reducido número SLGC fuertemente a 50 M (Fig. S1 A). La fuerte reducción numérica se asoció con una fuerte apoptosis. Sin embargo, esta fuerte apoptosis no fue promovido además por IR adicional (Fig. S1B). En las líneas GBM4 y GBM8, que ambos tienen p53 no funcional, por lo general observamos la apoptosis moderada (asociado a la catástrofe mitótica) más de 4 días después de la aplicación de las dosis moderadas o altas de IR 21 (Fig. 2AD). A la concentración subtóxica de 25 M, Akt inhibidor III mejoró esta apoptosis retrasado ligeramente en GBM8 pero no en las otras líneas SLGC. Expandir la Figura 2. PI3K / Akt inhibidores de la vía generalmente no promueven la muerte celular inducida por IR en SLGCs primarios. (A C) Porcentaje de anexina V / células PI positivas 2, 4, o 6 d después de la irradiación con 0, 2, o 10 Gy. Antes de la irradiación, se trataron previamente los cultivos durante 1 h con inhibidor de Akt III, LY294002 o PI-103. (D) Ejemplo de la muerte celular por citometría de flujo de los análisis. La población con disminución de la dispersión frontal de luz (FSC) en la muestra de 10 Gy irradiado refleja la contracción celular y la fragmentación típica de la apoptosis. Principios y mediados de células apoptóticas son anexina V-positivo, pero todavía no incluyen células apoptóticas finales de PI con integridad de la membrana débil están anexina V / PI-doble positivo. (E) clonogénico de supervivencia 14 d después del tratamiento con inhibidor de IR / Akt III (25 M) o PI-103 (0,6 M). Los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos de AC representan significa SD de tres experimentos independientes. La significación estadística se indica mediante un asterisco (P0.05). 50 M LY294002 o 0,6 M PI-103 inhibió fuertemente la proliferación celular (Fig. S1 A) pero no en general, inducir la apoptosis (basan en la exposición de anexina V y hacia adelante / lateral características de dispersión), ni tampoco lo general promueven la muerte celular radioinducido (según la evaluación de propidio captación de PI yoduro). Sorprendentemente, LY294002 y en mayor medida PI-103 incluso se reduce el número de células apoptóticas y muertas en - irradiated GBM4 y GBM8 SLGCs (Fig. 2BD). Por lo tanto, los efectos de sensibilización observados en ensayos clonogénicos, la evaluación de la formación de colonias a partir de células individuales, probablemente reflejan principalmente reducción de la proliferación (Fig. 2E). Cuando se usa como agentes únicos, la proliferación reducida inducida por los tres inhibidores se asoció con la detención G0 / G1 (Fig. 3A). Como era de esperar, IR causó la detención de G1 en línea GBM22 (la única línea con p53 funcional 21) y paro G2M en las líneas con p53 no funcional (por ejemplo GBM4). detención G2M IR inducida en líneas con p53 no funcional se redujo en presencia de los inhibidores, en particular PI-103. Esto probablemente contribuye a la apoptosis inducida por IR reducida, ya que nos encontramos previamente una correlación entre la detención G2M, catástrofe mitótica y apoptosis retardada en SLGCs deficientes en p53 - irradiated 21. Expandir la Figura 3. PI3K / Akt inhibidores de la vía reducen detención G2M e inducen la autofagia en SLGCs - irradiated. Las células (A) fueron tratados con inhibidor de Akt III (25 H), LY294002 (50 M), o PI-103 (0,6 M) durante 1 hy después se irradiaron con 10 Gy. Los análisis del ciclo celular se realizaron 24 h más tarde. (B) La conversión de citosólica LC3-I a autofagosoma asociada a LC3-II, y (C) cinética de H2AX fosforilación, una medida de DNA dañar los SLGCs fueron pretratados con inhibidores de la vía PI3K / Akt por 1 h antes de la irradiación con 10 Gy . Se muestran transferencias de Western representativas. Desde la autofagia generalmente se upregulated como un mecanismo de supervivencia en respuesta a inhibidores de la vía / Akt PI3K y en muchos tipos de células también en respuesta a IR 9. 24 27. También se examinó si se induce la autofagia en SLGCs tratados con IR y / o los tres diferentes / inhibidores de la vía PI3K Akt. Como se muestra en la Fig. 3B. unas horas después del tratamiento, la conversión de la cadena ligera de la proteína asociada a los microtúbulos 3 (LC3) - I en el lipidada LC3-II, que se incorpora en vesículas autofágicos durante la formación autofagosoma 28. de hecho, podría ser detectados por Western blot. la inducción de la autofagia podría ser confirmada mediante la realización de ensayos de flujo autofágicos con el inhibidor de la tarde etapa autofagia bafilomicina A1, que bloquea la acidificación lisosomal mediante la inhibición de la bomba de protones vacuolar, V-ATPasa 29 (Fig. S2). LY294002 y, en una de las dos líneas ensayadas, PI-103 mejora de forma significativa la serina 139 radioinducido fosforilación de la histona H2AX (Fig. 3C), un marcador de ADN doble filamento se rompe. Esto es consistente con la inhibición de la diana de DNA dependiente de la proteína quinasa (DNA-PK) por ambos inhibidores 23. La mucho más fuerte H2AX-mediada por aumento de PI-103 en comparación con GBM22 GBM4 presumiblemente refleja el importante papel de la DNA-PK en no homóloga unión de extremos, el mecanismo de reparación del ADN dominante en G1 30. donde la mayoría de la detención GBM22 SLGCs sobre IR (ver Fig. 3A). Por consiguiente, el inhibidor de la ADN-PK (NU7441) aumentó H2AX residual con más fuerza en GBM22 que en GBM4 SLGCs (Fig. S3). Sin embargo, el aumento de ADN de doble filamento se rompe en tratados-PI-103 GBM22 SLGCs parecía asocia principalmente con un bloque fuerte proliferación en lugar de con la muerte celular durante nuestro periodo de observación de hasta 2 semanas (véase más adelante). En líneas celulares de tumores establecidos, tradicionalmente cultivadas con FBS, utilizadas como controles, Akt inhibidor III mejorado IR inducida por la muerte celular / apoptosis relativamente fuerte en tres de cuatro líneas examinadas. Ly294002 tenía ya sea un efecto positivo, negativo o no, mientras que PI-103 también aquí tendía a suprimir la muerte celular IR inducida (Fig. S4). Promoción de la muerte celular inducida por IR por CQ-PI3K / Akt combinaciones inhibidor de la vía o CQ Dado que ninguno de los / inhibidores de la vía Akt fácilmente mejorado la muerte celular IR inducida por tres PI3K en nuestras líneas SLGC pero autofagia fue inducida, la hipótesis de que las combinaciones triples CQ con el inhibidor de la autofagia aplicable clínicamente podrían ser eficaces. CQ, como una base débil, eleva el pH lisosomal y por lo tanto, al igual que bafilomicina A1, inhibe los pasos finales de la autofagia (la fusión de autofagosomas con lisosomas y posterior degradación de la carga). La inhibición de la tarde autofagia es un disparador para la muerte celular por apoptosis, en particular en las células expuestas a agentes inductores de la autofagia 9. 31. 32. Para determinar las concentraciones de CQ subtoxic para experimentos de triple combinación, que utilizó por primera CQ como agente único o con 10 Gy IR. Sola, CQ reduce la proliferación de SLGCs dependiente de la dosis (Fig. S5A) y la muerte celular inducida (a través de la apoptosis) a altas concentraciones (barras abiertas en la Fig. 4A). La apoptosis se indujo en 3050 M CQ, excepto en GBM4 SLGCs donde se requiere 100 M CQ. GBM8, la línea más susceptibles a la radio - o CQ inducida por apoptosis, es la única de las cuatro líneas SLGC que expresa la proapoptótico proteína Bcl-2 Noxa (ver más abajo), y esta expresión fue inducida por CQ (Fig. S5B) . Expandir la Figura 4. CQ y IR sinérgicamente inducir apoptosis fuerte en SLGCs. (A) Panel superior: porcentaje de anexina V / células PI positivas 5 d después del tratamiento con CQ solo (barras blancas) o CQ plus IR (barras grises). Las células fueron pretratadas con CQ durante 1 h y luego se irradiaron con 10 Gy. Abajo a la izquierda: ejemplo del análisis de citometría de flujo de células apoptóticas y muertas parte inferior derecha: morfología apoptótica observada después de Hoechst 33342 / anexina V tinción a los 3 días después del tratamiento de combinación. (B) reducción de la supervivencia de las células clonogénicas 13 d después del tratamiento de combinación. (C) La reducción de tamaño de neuroesferas preformados 7 d después del tratamiento de combinación. Se determinó la viabilidad de las neuroesferas después de calceína-AM tinción. (D, E) transferencias de Western representativo que muestra el efecto de CQ o CQ plus IR en los niveles de expresión de caspasa-3 activada y la conversión LC3-I / II (D), así como en la fosforilación de H2AX (H2AX) (E). (F) La falta de inducción de muerte celular en fibroblastos humanos. En A y F, los datos representan las medias de tres experimentos independientes. Los experimentos en B y C se realizaron dos veces por triplicado. La significación estadística se indica mediante un asterisco (P0.05). Prueba de la doble combinación de CQ e IR, se encontró que CQ era ya suficiente para sensibilizar fuertemente las cuatro líneas SLGC a radioinducido apoptosis (barras grises en la Fig. 4A). Para G166 y GBM4 SLGCs, esta apoptosis fuertemente mejorada se observó a concentraciones bastante altas CQ (30 o 50 M, respectivamente). Por el contrario, ya se detectaron efectos proapoptóticos altamente sinérgicos en dosis de 10 o 20 M CQ en GBM22 y GBM8 SLGCs. Radiosensibilización por CQ también fue detectado en ensayos clonogénicos, así como después del tratamiento de esferoides SLGC preformadas de tamaño definido (Fig. 4B y C). La apoptosis inducida por CQ solo o en combinación con IR no fue acompañada de alteraciones del ciclo celular (Fig. S5C) y parecía estar en gran parte independiente de caspasas (Fig. 4D). Los niveles de daño del ADN radioinducido se mantuvieron sin cambios o reducida en presencia de CQ (Fig. 4E), a pesar de su efecto altamente sinérgico con IR. El efecto proapoptótico altamente sinérgica fue acompañado por la acumulación masiva del marcador autophagic LC3-II (Fig. 4D). Como se esperaba, solo CQ dependiente de la dosis causada acumulación de LC3-II. Sin embargo, el grado de conversión LC3-I / II fue siempre más alta en cultivos tratados con IR más CQ (Fig. 4D y véase a continuación). Como la diferencia en los niveles de LC3-II en ausencia vs. presencia de un inhibidor de la autofagia tarde refleja el número de vesículas autofágicas que se transportan a los lisosomas 29. 33. Este experimento confirma que la autofagia es inducida en los SLGCs en respuesta a IR. Por otra parte, indica que el bloqueo de los pasos finales de la autofagia combinado con la inducción de la autofagia mejorada provoca la acumulación masiva de autofagosomas, un disparador conocido de la apoptosis 31. 32. 34. Nota que después de períodos más largos de tratamiento único con IR (o inhibidor de la vía PI3K / Akt ) los niveles de LC3-II no se mejoraron más (ver también figuras. 5B y S2 y se comparan a un momento anterior después del tratamiento, como se muestra en la Fig. 3B). Desde sí LC3-II es un sustrato autofagia, esto es más probable debido a la entrega lisosomal mejorada de LC3-II cuando flujo autophagic está completamente activado 29. 33. CQ dosis de hasta 50 M no sensibilizar a los fibroblastos humanos normales a radioinducido muerte celular ( La Fig. 4F), lo que indica alguna especificidad tumor. Expandir la Figura 5. combinaciones triples de IR, una PI3K / Akt inhibidor de la vía y dosis bajas de CQ espectáculo aditivo a los efectos pro-apoptóticos altamente sinérgicos en SLGCs primarias. (A) Porcentaje de anexina V / células positivas PI 5 d después del tratamiento con 10 Gy, un inhibidor de la vía PI3K / Akt (25 M inhibidor de Akt III, 50 M LY294002, y 0,6 M PI-103) y CQ (a las dosis indicadas ), solos, o en combinaciones dobles o triples. Panel inferior: ejemplo de análisis de citometría de flujo de GBM22 SLGCs que muestra que la mayoría de las células tratadas con las combinaciones triples mueren por apoptosis. (B) análisis de Western blot que muestra una fuerte acumulación de LC3-II en muestras SLGC con altas proporciones de células PI positivas anexina V /. Además, se muestran los niveles de expresión de pro-y moléculas antiapoptóticas y la caspasa-3 escindido. Los datos en (A) son medios de tres experimentos independientes. La significación estadística se indica mediante un asterisco (P0.05). A continuación se probó combinaciones triples de inhibidores de la vía PI3K / Akt con 10 Gy IR y CQ en CQ dosis menores que las que actúan sinérgicamente en los dobles combinaciones con IR. Tales combinaciones triples eran de hecho muy eficaz en todas las líneas SLGC (Fig. 5A y la Fig. S6). La potenciación de la muerte celular más fuerte se observó en radioinducido SLGCs de GBM22. En esta línea, efectos altamente sinérgicos se lograron mediante la combinación de un Gy de irradiación 10 con una dosis baja de CQ (10 M) y dosis subtóxicas de los inhibidores de la vía de tres PI3K / Akt diferente. En GBM4 y G166 SLGCs, solamente Akt inhibidor III causó efectos sinérgicos pro-apoptóticos, y en GBM8 SLGCs, puesto que sólo en IR causó cierta apoptosis, los efectos fueron sub-aditivo sinérgico. La apoptosis inducida por las fuertes combinaciones triples fue acompañada por una fuerte acumulación del marcador de autofagia LC3-II. En GBM22 SLGCs, la apoptosis también fue acompañada por la regulación por disminución de la proteína anti-apoptótica MCL-1 (Fig. 5B). Efectos del tratamiento de combinación triple a dosis bajas de IR, CQ, y PI-103 Por último, nos muestran que las combinaciones triples de IR, la clase de doble I PI3K / inhibidor de mTOR PI-103, y CQ también causaron efectos pro-apoptóticos sinérgicos cuando GBM22 SLGCs, que están celular completamente muerte resistente a 10 Gy de una sola dosis de la irradiación, fueron tratados con dosis relativamente bajas de los tres componentes (3,5 Gy IR, 0,5 M PI-103, y 5 M CQ), un resultado también de interés para una posible aplicación clínica ya que las dosis más bajas causan menos efectos secundarios. Aunque la combinación doble de PI-103 e IR era fuertemente citostático (Fig. 6A y B paneles de la derecha), aumentó significativamente el número de células apoptóticas o muertas sólo se encontraron en los cultivos tratados con la combinación triple incluyendo CQ. Esto fue cierto para todos los puntos temporales a prueba hasta el d13 después del tratamiento (Fig. 6A y B). También aquí, la muerte celular / apoptosis se asoció con la conversión más fuerte de LC3-I en LC3-II (Fig. 6C). Esta fuerte conversión LC3-I / II en las muestras tratadas con la combinación triple en comparación con las combinaciones dobles con CQ indica que las combinaciones dobles de IR y un inhibidor de la vía PI3K / Akt activan más fuertemente la autofagia de IR o PI3K inhibidor de la vía / Akt solo, y que más vesículas autofágicas acumulan tras el tratamiento con la combinación triple en comparación con las dobles combinaciones con CQ 29. 33. Estos resultados son similares a los obtenidos con bafilomicina A1 (véase la Fig. S2). Expandir la Figura 6. Las dosis bajas de IR, CQ y PI-103 sinérgicamente induce la apoptosis en GBM22 SLGCs. (A, B) Izquierda: Porcentaje de anexina células positivas PI 5 V / o 13 d después del tratamiento con IR (3,5 Gy), CQ (5 M) o PI-103 (0,5 M) solo, con combinaciones dobles o triples. el número de células después de la tinción con azul de tripano: derecho. El panel inferior en A: citometría de flujo los datos que muestran que la muerte celular se produjo principalmente a través de la apoptosis. (C) Análisis de transferencia Western de LC3-I / II de conversión y de los niveles de expresión de p21. No sólo observado efectos sinérgicos en los ensayos de muerte celular de apoptosis / mundiales, también se detectaron fuertes efectos en los ensayos de formación de esfera a cabo como un ensayo sustituto de células madre para evaluar el efecto sobre las células clonogénicas. También aquí, la combinación de triple impedido más eficazmente la formación de esfera (Fig. 7A). Sin embargo, también en este ensayo la doble combinación de PI-103 y una irradiación de 3,5 Gy resultaron ser muy eficaz, posiblemente debido a la fuerte efecto citostático sobre SLGCs (ver Fig. 6A y B). La triple combinación también fue más eficaz cuando se trataron tridimensionales esferas de tamaño definido. Casi no había células viables varios días después del tratamiento según la evaluación de la tinción de células vivas con un colorante fluorescente viabilidad (Fig. 7B). En contraste, no la muerte celular significativa podría ser detectada en fibroblastos humanos normales tratados con esta combinación triple (Fig. S7), lo que demuestra que no sólo las combinaciones dobles de IR y CQ (véase la Fig. 4F), sino también que este tratamiento de combinación triple exhibe algunas tumor especificidad de la célula. Expandir la Figura 7. Los efectos sinérgicos de la mínima dosis de combinación triple incluyendo PI-103, en ensayos de sustitución de células madre. (A) cultivos monocapa adherente de GBM22 SLGCs fueron tratados durante 5 d como se describe en la Fig. 6. después se sembraron en medio libre de suero para formar neuroesferas. Siete días más tarde neuroesferas totales se contaron y se fotografiaron. (B) Tratamiento de neuroesferas 3D preformados. Las células se sembraron para formar una neurosphere por pocillo y 2 d después tratados como se indica. 7 d después del tratamiento, neuroesferas se tiñeron con calceína-AM para determinar la viabilidad y el diámetro de las esferas. Los datos en (A y B) son medios de tres experimentos independientes. La significación estadística se indica mediante un asterisco (P0.05). Discusión general se supone que los CAC contribuyen decisivamente a la resistencia de los tumores malignos de quimio y radioterapia y que la vía de Akt es particularmente importante para la supervivencia CSC. Sin embargo, cómo los inhibidores farmacológicos de la vía PI3K / Akt afectan a la supervivencia después de la irradiación y la muerte celular de células madre cancerosas humano primario no se ha informado hasta ahora. Los glioblastomas son resistentes a las terapias convencionales. Por lo tanto, se necesitan con urgencia opciones terapéuticas novedosas. Para identificar los agentes que promueven la muerte SLGC, seleccionamos un inhibidor de Akt y dos inhibidores de PI3K / mTOR para estudiar sus efectos sobre el radiorespuesta de SLGCs primarias. Los dos PI3K / inhibidores de mTOR mostró muy fuertes respuestas citostáticos, pero, sorprendentemente, no promovió fácilmente la muerte celular de SLGCs y, de hecho, incluso tendía a reducirla. Akt inhibitior III promovió sólo ligeramente la muerte celular inducida por IR en una de las líneas SLGC examinados. La respuesta a estas combinaciones dobles se asoció con la autofagia y mostramos aquí por primera vez que la autofagia finales CQ inhibidor solo o en combinación con inhibidores de la vía PI3K / Akt seleccionado promueve fuertemente la muerte celular inducida por IR de células madre cancerosas humanas primarias. Nuestro estudio debe ser de alta relevancia clínica no sólo porque se utilizó un inhibidor de la autofagia finales clínicamente aplicable, sino también porque todos los datos presentados se han obtenido a partir de células tumorales madre-como derivados del tumor pacientes, una población piensa que es crítico para la progresión tumoral y resistencia al tratamiento que debe ser erradicado con el fin de lograr una supervivencia libre de recaída a largo plazo. apoptosis primaria (p53-dependiente) no es una reacción preferida de las células de tumores sólidos a los tratamientos genotóxicos. Sin embargo, en la mayoría de las líneas SLGC con p53 no funcional, por lo general detectar algunos apoptosis después de 4 días después de IR con dosis únicas moderadas o altas (por ejemplo 5 o 10 Gy) 21 tal como se utiliza en el tratamiento clínico hipofraccionado regímenes 35. Como muestran estas líneas pronunciadas SLGC G2M detención asociada a la catástrofe mitótica, esto es, presumiblemente, la apoptosis secundaria después de una catástrofe mitótica letal. Por el contrario, SLGCs con p53 funcional simplemente detienen en G1 y no muestran la muerte celular por más de 2 semanas después de la irradiación. Durante este período, también no vemos la muerte celular en la línea SLGC deficientes en p53 G166, que, a pesar de la detención G2M, no presenta características de catástrofe mitótica después de IR 21. Por lo tanto, si bien existen diferencias en la radiorespuesta de los CAC, hay es una gran necesidad de radiosensibilizadores CSC, particularmente para tumores malignos altamente quimio - y radio-resistentes. En triples combinaciones con IR y un inhibidor de PI3K / Akt, CQ promueve fuertemente SLGC apoptosis a concentraciones entre 530 M, y, en doble combinación con IR en el rango de 1,050 M. Nuestro hallazgo de que CQ promueve fuertemente la muerte celular en SLGCs - irradiated puede contribuir a explicar los resultados de un estudio clínico de Sotelo et al. que informó de que CQ, añadido a un protocolo terapéutico convencional (cirugía más radioquimioterapia) para glioblastoma, se duplicó la mediana de supervivencia global en comparación con grupos de control 36. Radiosensibilización por CQ ya se ha informado de líneas celulares tumorales convencionales, sobre todo en combinación con la hipertermia 37. 38. pero radiosensibilización de células de glioma o células madre cancerosas altamente radioresistant, y tales fuertes efectos proapoptóticos sinérgicos de IR y CQ como se informa aquí de manera uniforme para un panel de SLGCs primarias no se han descrito antes. Se pueden alcanzar concentraciones de 550 M CQ CQ terapéuticamente es un fármaco antimalárico barato, también se utiliza para el tratamiento de la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico y otras enfermedades del tejido conjuntivo 39. Las concentraciones plasmáticas máximas en la sangre de aproximadamente 15 M reportados en la literatura para CQ 40 son igual o ligeramente por debajo de las concentraciones encontradas aquí para radiosensibilizar SLGCs. Sin embargo, CQ atraviesa la barrera hematoencefálica. También se acumula en ciertos tejidos y órganos a niveles muy altos, y los valores de 1030 veces mayor que las concentraciones en plasma de sangre se han descrito para el cerebro 41. Por lo tanto, las concentraciones de CQ necesarios para radiosensibilización de células madre cancerosas puede de hecho ser alcanzable por la administración sistémica al menos para algunos entidades de tumores incluyendo tumores cerebrales. Controlada la aplicación local de CQ puede ser una estrategia de entrega alternativo en los tumores cerebrales. Es un fondo molecular determinado asociado con radiosensibilización mediada por CQ de SLGCs se observó aumento de la muerte celular fuerte para las cuatro líneas SLGC, incluyendo G166 y GBM22, que por lo menos hasta dos semanas después de la irradiación, no muestran ningún signo de muerte celular incluso después de dosis únicas elevadas de IR como 10 Gy 21. Sin embargo, la apoptosis en dosis CQ inferior (10 o 20 M) sólo se observó en irradiado GBM22 y GBM8 SLGCs. La línea de GBM22 es la única línea que expresa p53 funcional, y GBM8 la única línea que expresa la proapoptótico miembro de la familia Bcl-2 Noxa. Una influencia positiva de p53 funcional y una influencia de miembros de la familia Bcl-2, tales como Bax, Bak, Bcl-XL y ya se han dado cuenta cuando las líneas celulares tumorales convencionales fueron expuestos a CQ como agente único 42 45. Noxa se encuentran aquí para ser inducida por CQ. Noxa Recientemente se ha demostrado para promover la muerte celular por autofagia en la expresión de la proteína oncogénica Ras se requieren 46. Los futuros experimentos para averiguar si Noxa y p53 también contribuyen a la mejora de la muerte celular mediada por CQ en células madre cancerosas - irradiated. Mecánicamente, el fuerte sinergismo proapoptótico de los resultados probables IR / CQ-cotratamiento de la combinación de la inducción de la autofagia (por el tratamiento genotóxico) con fuerte inhibición de los finales de los pasos de la autofagia (por CQ) 9. 31. 32. Clínicamente, la radioterapia pueden tener una ventaja sobre la quimioterapia, ya que es un tratamiento genotóxico local. La inducción de daño en el ADN por CQ descrito por otros 47 también podría explicar aumento de la apoptosis inducida por IR. Sin embargo, se observó ningún cambio o reducción de daños en el ADN radioinducido según la evaluación de H2AX. La reducción de daño en el ADN es consistente con la opinión de que CQ tiene propiedades antimutagénicas 48. que también pueden contribuir a sus efectos antitumorales. Con dos excepciones (inhibidores de Akt III en GBM8 y Ly294002 en GBM22 SLGCs), encontramos ya sea ningún aumento o incluso la reducción de la muerte SLGC radiogenic en presencia de inhibidores de la vía PI3K / Akt. Se observó muerte celular reducida para SLGCs deficientes en p53 cotreated con la PI3K / mTOR inhibidores de LY294002 o PI-103. Como previamente se demostró que p53-deficiencia, la proliferación y la catástrofe mitótica asociada con la detención G2M correlacionan con IR inducida por apoptosis SLGC 21. disminuido fuertemente la proliferación y la disminución de detención G2M probable contribuir a los efectos de la apoptosis inhibidor de LY294002 y PI-103 en - irradiated SLGCs además de la inducción de la autofagia. La falta de apoptosis y efectos citostáticos en gran medida también se han observado en la monoterapia con inhibidores de PI3K / mTOR doble en las líneas convencionales de glioma 4. 23. 27. A primera vista, esto parece sorprendente dada la fuerte inhibición comparable del regulador de la apoptosis importante Akt por tales inhibidores fuerte inhibición de Akt por PI-103 (a / pan inhibidor de mTOR PI3K) puede ser debido a la inhibición de mTORC2, la principal quinasa celular de fosforilación de la serina 473 de Akt 4. la fuerte respuesta citostático G1 en conjunción con la autofagia parece facilitar la supervivencia celular en el presencia de tales inhibidores. En cultivos tratados con combinaciones triples letales, la apoptosis se asoció con muy fuerte conversión LC3-I / II, lo que refleja la acumulación de grandes cantidades de vesículas autofágicas, conocidos preceder la muerte celular apoptótica cuando la autofagia tarde se bloquea 31. 32. 34. En el 5A.